________________________________________
ทำไมการนำส่ง PDRN ผ่านผิวจึงเป็นเรื่องท้าทาย?
ผิวหนังไม่ได้ถูกออกแบบมาให้สารทุกชนิดผ่านเข้าไปได้ง่าย โดยชั้นนอกสุดของผิวหรือ Stratum Corneum (SC) ทำหน้าที่เป็น biological barrier ที่มีประสิทธิภาพสูงในการจำกัดการผ่านเข้าสู่ผิวของสารจากภายนอก ซึ่งโดยทั่วไป ความสามารถในการซึมผ่านผิวขึ้นอยู่กับหลายปัจจัย เช่น
Molecular size • Molecular weight • Solubility • Lipophilicity • Charge • Stability • Formulation • Delivery system
สำหรับ PDRN ความท้าทายยิ่งเพิ่มขึ้น เพราะ PDRN ไม่ใช่ small molecule ทั่วไป แต่เป็นส่วนประกอบในกลุ่ม DNA/polynucleotide fragments ซึ่งมีขนาดและคุณสมบัติแตกต่างกันไปตามแหล่งที่มาและกระบวนการผลิต ดังนั้น การระบุเพียงว่าเครื่องสำอางมี “PDRN” จึงยังไม่เพียงพอที่จะสรุปว่า PDRN จากผลิตภัณฑ์นั้นสามารถผ่าน skin barrier และไปถึงชั้นผิวเป้าหมายได้
________________________________________
PDRN ไม่ได้เหมือนกันทั้งหมด
หนึ่งในประเด็นสำคัญผลิตภัณฑ์หรือวัตถุดิบที่ใช้คำว่า PDRN อาจมีลักษณะแตกต่างกันอย่างมาก เช่น
• PDRN หรือ Sodium DNA จากแหล่งต่าง ๆ
• Hydrolyzed DNA หรือ DNA fragments ที่ลด molecular size
• Plant-derived DNA/PDRN
• PDRN ที่อยู่ใน liposome, vesicle หรือ nanocarrier
• PDRN ที่ใช้ cationic carrier หรือ polymer complex
• PDRN ร่วมกับ extracellular vesicle/exosome-based delivery systems
ดังนั้น Source of PDRN, molecular-size distribution, carrier system และ finished formulation ล้วนมีผลต่อพฤติกรรมการนำส่ง จึงไม่ควรนำผลการศึกษาการซึมของ PDRN ชนิดหนึ่งไปสรุปแทน PDRN อีกชนิดหนึ่งโดยตรง
________________________________________
Delivery Technology ช่วย PDRN ได้อย่างไร?
หนึ่งในแนวทางสำคัญของ formulation science คือการออกแบบระบบนำส่งเพื่อช่วยให้ Active สามารถ interact กับ skin barrier ได้เหมาะสมขึ้น ซึ่งเทคโนโลยีที่พบในงานพัฒนาเครื่องสำอางมีตั้งแต่
Liposome • Niosome • Nanoemulsion • SLN/NLC • Ethosome • Transfersome • Exosome/Extracellular Vesicle • Cationic Lipid/Polymer Complex
ซึ่งแต่ละระบบมีหลักการและความเหมาะสมแตกต่างกัน ตัวอย่างเช่น liposome และ vesicular systems สามารถ encapsulate active และเปลี่ยน interaction ระหว่าง active กับ skin surface ขณะที่ cationic systems อาจอาศัย electrostatic interaction กับสารที่มีประจุลบ เช่น nucleic acids
สำหรับ PDRN ซึ่งเป็น nucleic-acid-based material การออกแบบ carrier จึงต้องพิจารณาทั้ง ขนาด ประจุ ความคงตัวของ PDRN ความสามารถในการบรรจุ และพฤติกรรมของ carrier บนผิว และที่สำคัญ การมีชื่อเทคโนโลยี เช่น “nano”, “liposome” หรือ “exosome” ไม่ได้เป็นหลักฐานโดยตัวมันเองว่า PDRN สามารถซึมถึงชั้นผิวเป้าหมายได้ สิ่งนั้นต้องพิสูจน์ด้วยการทดลองเท่านั้น
________________________________________
แล้วเราจะพิสูจน์ Skin Penetration ได้อย่างไร?
คำว่า “พิสูจน์การซึมเข้าสู่ผิว” จริง ๆ แล้วสามารถหมายถึงคำถามหลายระดับ เช่น
- Active ผ่านผิวไปกี่เปอร์เซ็นต์?
- Active อยู่ที่ความลึกเท่าไร?
- อยู่ใน Stratum Corneum, Epidermis หรือชั้นที่ลึกกว่านั้น?
- สิ่งที่ตรวจพบคือ PDRN จริง หรือเป็นเพียง Carrier?
- PDRN หลังผ่านผิวยังคง molecular identity อยู่หรือไม่?
จึงไม่มีเครื่องมือเพียงชนิดเดียวที่ตอบทุกคำถามได้ ซึ่ง IIC ขอนำทุกท่านไปรู้จักกับเทคนิคที่สำคัญและใช้กันอยู่ในปัจจุบัน กล่าวคือ
________________________________________
1. Franz Diffusion Cell — วัดการผ่านผิวเชิงปริมาณ
หนึ่งในเทคนิคพื้นฐานและสำคัญที่สุดคือ In Vitro Permeation Test (IVPT) ด้วย Diffusion Cell หรือ Franz Diffusion Cell หลักการคือวางตัวอย่างผิวหนังระหว่าง donor และ receptor compartment จากนั้นทาผลิตภัณฑ์ลงบนผิวและติดตามปริมาณสารที่ผ่านเข้าสู่หรือผ่านผิวตามเวลาต่างๆ ซึ่งแนวคิดนี้สอดคล้องกับ OECD Test Guideline 428: Skin Absorption – In Vitro Method ซึ่งระบุการใช้ skin sample แยกระหว่าง donor และ receptor chamber เพื่อศึกษาการดูดซึมของสารผ่านผิว และสามารถใช้เปรียบเทียบ dermal delivery จาก formulation ที่แตกต่างกันได้
สำหรับสารทั่วไปสามารถวิเคราะห์ receptor fluid หรือส่วนต่าง ๆ ของผิวด้วย HPLC หรือ LC-MS/MS ตามความเหมาะสม แต่สำหรับ PDRN/DNA การวิเคราะห์อาจต้องใช้วิธีที่มี specificity ต่อ nucleic acid มากขึ้น เช่น sequence-specific analytical approach, qPCR/ddPCR หรือวิธีที่ผ่านการ validate สำหรับ PDRN ที่กำลังศึกษา ดังนั้น Franz Cell บอกเราได้ดีว่า “ผ่านเข้าไปเท่าไร?” แต่ยังอาจต้องใช้เทคนิคอื่นร่วมด้วยเพื่อบอกว่า “อยู่ตรงไหน?”
________________________________________
2. Tape Stripping — ดูการกระจายตัวใน Stratum Corneum
Tape Stripping เป็นเทคนิคที่ใช้ adhesive tape ลอกชั้น Stratum Corneum ออกทีละชั้นหลังจากทาผลิตภัณฑ์ จากนั้นสามารถนำแต่ละ tape ไปวิเคราะห์ปริมาณ Active ด้วย analytical technique ที่เหมาะสม ข้อดีคือสามารถสร้าง depth-related distribution profile ใน Stratum Corneum ได้โดยไม่ต้องอาศัย imaging system ที่ซับซ้อน จึงเหมาะสำหรับคำถาม เช่น
Active ส่วนใหญ่อยู่บนผิว หรือเข้าสู่ Stratum Corneum แล้ว?
อย่างไรก็ตาม เทคนิคนี้ให้ข้อมูลหลักในบริเวณ Stratum Corneum และไม่ได้ให้ spatial image ของ epidermis/dermis โดยตรง
________________________________________
3. Confocal Raman Spectroscopy — มอง Chemical Profile ตามความลึกของผิว
Confocal Raman Microspectroscopy (CRM) เป็นเทคนิคที่น่าสนใจมากสำหรับ Cosmetic Skin Penetration เพราะสามารถวิเคราะห์ molecular/chemical information ของผิวตามระดับความลึก โดยไม่จำเป็นต้องใช้ fluorescent label ในหลายกรณี งานวิจัยแสดงให้เห็นว่า Confocal Raman สามารถนำมาใช้สร้าง penetration profile ของสารที่ทาบนผิว และสามารถวิเคราะห์ molecular concentration gradient ใน Stratum Corneum ได้ในระดับไมโครเมตร นอกจากนี้ยังมีการนำ Raman mapping มาใช้ติดตาม penetration/permeation ของ cosmetic active ingredients ด้วยเช่นกัน ข้อดีสำคัญคือ
Label-free • Non-destructive • Chemical information • Depth profiling
แต่มีเงื่อนไขสำคัญว่า Active ต้องมี Raman signature ที่สามารถแยกออกจาก background ของผิวและ formulation ได้เพียงพอ ดังนั้นสำหรับ PDRN โดยเฉพาะที่มีความเข้มข้นต่ำหรืออยู่ในสูตรที่มีองค์ประกอบซับซ้อน ไม่ควรสรุปว่า Raman สามารถตรวจ PDRN ได้โดยตรงทุกสูตร โดยไม่ทำ feasibility/specificity study ก่อน ส่วนนี้จึงเป็นข้อจำกัดที่สำคัญมากในการออกแบบการทดลอง
________________________________________
4. CLSM / Fluorescence Imaging — เห็นเส้นทางและตำแหน่งการนำส่ง
Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) สามารถสร้างภาพ 2D/3D เพื่อศึกษาตำแหน่งและเส้นทางการกระจายตัวของสารหรือ delivery system ในผิวซึ่งเหมาะอย่างยิ่งกับการศึกษา
Liposome • Nanoparticle • Vesicle • Exosome/EV • Delivery Carrier
โดยเฉพาะเมื่อสามารถติด fluorescent label กับ active หรือ carrier ได้ CLSM จึงช่วยตอบคำถามว่า
“ระบบนำส่งสารเข้าไปอยู่ตรงไหนของผิว?”
และมีการใช้ confocal imaging ในงานศึกษากลไกของ skin penetration enhancement มาเป็นเวลานาน อย่างไรก็ตาม ต้องระวังการตีความ เพราะการเห็น fluorescence ในผิว ไม่ได้แปลโดยอัตโนมัติว่า PDRN ที่สมบูรณ์อยู่ในตำแหน่งเดียวกัน หากสิ่งที่ label เป็น carrier หรือ dye ดังนั้นการออกแบบ label และ control จึงมีความสำคัญมาก
________________________________________
5. qPCR / ddPCR — เมื่อสิ่งที่ต้องการพิสูจน์คือ DNA/PDRN
สำหรับ PDRN มีความท้าทายที่แตกต่างจาก active ทั่วไป เพราะสิ่งที่เราสนใจคือ DNA-derived material ดังนั้น หากสามารถกำหนด sequence หรือ molecular target ที่จำเพาะได้ เทคนิคอย่าง qPCR หรือ ddPCR อาจช่วยเพิ่ม specificity ในการตรวจ DNA ที่ได้จาก skin layer, receptor fluid หรือ sample ที่เก็บจาก penetration study จุดแข็งของวิธีนี้คือความไวและความจำเพาะสูง แต่ต้องมี appropriate target sequence, validated extraction procedure, controls และ analytical method ที่สามารถแยก signal ของ test material ออกจาก biological background ได้ จึงไม่ใช่ว่า PDRN ทุกชนิดสามารถนำไปตรวจด้วย PCR ได้ทันทีโดยไม่พัฒนาวิธีวิเคราะห์ก่อน
________________________________________
6. เทคนิคขั้นสูงอื่น ๆ — เมื่อเราต้องการเห็นมากกว่า “ซึมหรือไม่ซึม”
สำหรับงานวิจัยขั้นสูง ยังมีเทคนิคอีกหลายประเภท เช่น
Two-Photon Microscopy / FLIM — imaging ในระดับลึกและศึกษาปฏิสัมพันธ์ในเนื้อเยื่อ
SRS/CARS Microscopy — chemical imaging ที่สามารถให้ข้อมูลแบบ label-free สำหรับสารที่เหมาะสม
MALDI-MSI — molecular mapping บน tissue section
LC-MS/MS Skin Layer Analysis — วิเคราะห์ปริมาณสารในแต่ละชั้นของเนื้อเยื่อ
TEM/Cryo-TEM — เหมาะสำหรับดูโครงสร้างและตำแหน่งของ nanocarrier มากกว่าการยืนยัน chemical identity ของ PDRN โดยตรง
ซึ่งงานทบทวนด้าน optical skin penetration แสดงให้เห็นว่าเทคนิคต่างๆ เช่น CLSM, two-photon, Raman, SRS และเทคนิค optical imaging อื่นๆ มีข้อดีและข้อจำกัดแตกต่างกัน ไม่มีเทคนิคเดียวที่เหมาะกับทุกสารและทุกคำถามที่เราต้องการทราบ
________________________________________
เทคนิคไหนเหมาะกับ PDRN?
คำตอบคือ ขึ้นอยู่กับสิ่งที่ต้องการพิสูจน์
คำถามที่ต้องการตอบ เทคนิคที่ควรพิจารณา
PDRN/active ผ่านผิวได้เท่าไร Franz Diffusion Cell + specific analytical method
อยู่ใน Stratum Corneum เท่าไร Tape Stripping + appropriate assay
ต้องการ Chemical Depth Profile Confocal Raman*
ต้องการเห็นตำแหน่ง/เส้นทางของ Carrier CLSM / Two-Photon*
ต้องการตรวจ DNA/PDRN อย่างจำเพาะ qPCR / ddPCR*
ต้องการ Molecular Mapping ในเนื้อเยื่อ MALDI-MSI / advanced imaging
ต้องการประเมินทั้ง Carrier + PDRN Combination / Orthogonal Approach
*ต้องประเมิน feasibility และพัฒนาวิธีให้เหมาะกับ PDRN/สูตรที่ศึกษา
________________________________________
สำหรับ PDRN “Orthogonal Approach” อาจสำคัญกว่าการเลือกเครื่องมือเพียงชนิดเดียว
หากต้องการสร้างหลักฐานที่แข็งแรงสำหรับ advanced delivery system การใช้เทคนิคเพียงชนิดเดียวอาจตอบคำถามได้ไม่ครบ ตัวอย่างเช่น การศึกษา PDRN delivery system อาจออกแบบเป็น
Franz Diffusion Cell
↓
วัด penetration/permeation เชิงปริมาณ
+ Skin Layer Analysis / Tape Stripping
↓
ดูการกระจายตามชั้นผิว
+ qPCR/ddPCR หรือ PDRN-specific assay
↓
ยืนยันว่า signal ที่ตรวจพบสัมพันธ์กับ DNA/PDRN เป้าหมาย
+ CLSM / Raman / Advanced Imaging
↓
สร้าง spatial/depth evidence ของ delivery system
แนวทางนี้ช่วยลดความเสี่ยงของการตีความผิด เช่น พบ fluorescence ของ carrier แล้วสรุปว่า PDRN ซึม หรือพบ total DNA แล้วสรุปว่าเป็น PDRN จากผลิตภัณฑ์
________________________________________
“Skin Penetration” และ “Skin Permeation” ไม่เหมือนกัน
อีกคำที่ควรแยกให้ชัดในการสื่อสารผลการทดสอบคือ
Skin Penetration หมายถึงสารเข้าสู่และกระจายอยู่ภายในชั้นผิว
ขณะที่
Skin Permeation เน้นการเคลื่อนผ่าน skin barrier ไปยังอีกด้านหนึ่งของผิว
ดังนั้น การที่ Active ไม่พบใน receptor fluid ของ Franz Cell ไม่ได้หมายความโดยอัตโนมัติว่า Active “ไม่เข้าสู่ผิว” เพราะอาจเกิด deposition หรือ retention อยู่ในบางชั้นของผิว ด้วยเหตุนี้ OECD TG 428 จึงพิจารณาทั้ง receptor fluid และ distribution ของ test substance ภายในระบบการทดสอบ เพื่ออธิบาย absorption profile อย่างเหมาะสม
________________________________________
อย่าดูเพียง Molecular Weight
แนวคิดเรื่อง molecular size มีประโยชน์ในการประเมินเบื้องต้น แต่การทำนาย Skin Penetration ไม่ควรใช้ Molecular Weight เพียงตัวแปรเดียว ซึ่งสำหรับ PDRN ต้องพิจารณาร่วมกันอย่างน้อยคือ
Molecular size/distribution + Charge + Solubility + Stability + Concentration + Carrier + Formulation + Skin model + Exposure time
โดยเฉพาะเมื่อ PDRN ถูก encapsulate หรือ complex กับ delivery system สิ่งที่สัมผัส skin barrier อาจไม่ใช่ free PDRN เพียงอย่างเดียว ดังนั้น คำถามที่เหมาะสมกว่า “PDRN มี MW เท่าไรจึงซึมผิวได้?” คือ “PDRN ชนิดนี้ ใน delivery system และ finished formulation นี้ สามารถไปถึงบริเวณเป้าหมายของผิวภายใต้เงื่อนไขการใช้จริงได้หรือไม่?” และคำตอบควรมาจาก experimental evidence
________________________________________
จาก Delivery Claim สู่ Scientific Evidence
สำหรับอุตสาหกรรมเครื่องสำอางยุคใหม่ การกล่าวว่า Active ใช้ Nano Delivery, Liposome, Exosome หรือ Advanced Delivery Technology อาจเป็นจุดเริ่มต้นที่น่าสนใจ แต่ไม่ควรถือเป็นข้อพิสูจน์การซึมผ่านผิวในตัวเอง โดยหลักฐานที่มีคุณค่ามากกว่าคือการแสดงว่า
Active คืออะไร → มีคุณสมบัติอย่างไร → Delivery system ทำงานอย่างไร → ไปถึงบริเวณใดของผิว → ตรวจด้วยวิธีอะไร → ผลที่ได้สัมพันธ์กับประสิทธิภาพของผลิตภัณฑ์อย่างไร
OECD เองระบุว่า in vitro skin absorption methods สามารถใช้เปรียบเทียบการนำส่งสารจาก formulation ที่แตกต่างกัน และเป็นโมเดลที่มีประโยชน์สำหรับการประเมิน percutaneous absorption แต่การเลือกวิธีควรสอดคล้องกับวัตถุประสงค์และข้อกำหนดที่เกี่ยวข้อง นี่คือจุดที่ Formulation Science + Analytical Science + Efficacy Testing ต้องทำงานร่วมกัน
________________________________________
IIC: From Active Ingredient to Skin Penetration Evidence
สำหรับการพัฒนาผลิตภัณฑ์ที่มี PDRN, Peptides, Botanical Actives หรือ Advanced Delivery Systems การออกแบบการทดสอบควรเริ่มจาก คุณสมบัติของ Active และคำถามที่ต้องการพิสูจน์ ไม่ใช่เริ่มจากการเลือกเครื่องมือก่อน ซึ่งแนวทางการศึกษาสามารถออกแบบเป็น
Active Characterization → Delivery System → Finished Formulation → Skin Penetration Study → Analytical Confirmation → Biological/Efficacy Evidence
เพื่อสร้างหลักฐานที่เชื่อมโยงตั้งแต่ “มีสารสำคัญอยู่ในสูตร” ไปจนถึง “สารสำคัญสามารถถูกนำส่งไปยังบริเวณที่เกี่ยวข้องกับเป้าหมายของผลิตภัณฑ์ได้หรือไม่”
________________________________________
References
OECD Test No. 428: Skin Absorption – In Vitro Method, OECD Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies
Optical Methods for Non-Invasive Determination of Skin Penetration
In Vivo Confocal Raman Spectroscopy in Skin Research
โดย กฤษณพล หัตถิยา, ผู้จัดการฝ่ายวิจัยและพัฒนา ส่วนงานสนับสนุนด้านเทคนิค, บริษัท อินเตอร์เนชั่นแนล อินโนเวชั่น เซ็นเตอร์ จำกัด, ประเทศไทย
